ATP 含量檢測試劑盒說明書

注意：本產(chǎn)品試劑有所變動，請注意并嚴(yán)格按照該說明書操作。

  貨號：

規(guī)格：100T/96S

產(chǎn)品組成：使用前請認(rèn)真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系技術(shù)人員。

微量法

試劑名稱規(guī)格保存條件

提取液液體 100 mL×1 瓶4℃保存

試劑一液體 20 mL×1 瓶4℃保存

試劑二粉劑×1 瓶4℃保存

試劑三液體 4 mL×1 瓶4℃保存

試劑四粉劑×2 支-20℃保存

試劑五粉劑×1 瓶4℃保存

試劑六粉劑×2 支-20℃保存

標(biāo)準(zhǔn)品粉劑×1 支-20℃保存

溶液的配制：

1、 試劑二：臨用前加入 3.5 mL 蒸餾水充分溶解，可加熱促進(jìn)溶解；

2、 試劑四：臨用前取 1 支加入 0.2 mL 蒸餾水溶解，可分裝后-20℃保存，避免反復(fù)凍融；

3、 試劑五：臨用前加入 1 mL 蒸餾水；

4、 試劑六：臨用前取 1 支加入 0.25 mL 蒸餾水備用，可分裝后-20℃保存，避免反復(fù)凍融；

5、 標(biāo)準(zhǔn)品：5 mg ATP。臨用前加入 0.826 mL 蒸餾水配成 10 μmol/mL 的 ATP 標(biāo)準(zhǔn)溶液；

6、 工作液的配制：臨用前請按試劑二(mL)：試劑三(mL)：試劑四(mL)：試劑五(mL)：試劑六(mL)=1：1：0.1：

0.4：0.1 的比例配制，現(xiàn)配現(xiàn)用。

產(chǎn)品說明：

ATP 廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，是生物能量通貨，能荷是描述細(xì)胞能量代謝狀態(tài)的主要參數(shù)。測定 ATP 含量并且計算能荷，能夠反映能量代謝狀態(tài)。

HK 催化葡萄糖和 ATP 合成 6-磷酸葡萄糖，6-磷酸葡萄糖脫氫酶進(jìn)一步催化 6-磷酸葡萄糖脫氫生成 NADPH， NADPH 在 340nm 有特征吸收峰，NADPH 和 ATP 含量成正比，以此反應(yīng) ATP 含量。

技術(shù)指標(biāo)：

最低檢出限：0.0026 μmol/mL

線性范圍：0.01953-3 μmol/mL

注意：實驗之前建議選擇 2-3 個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計/酶標(biāo)儀、水浴鍋、可調(diào)式移液槍、微量石英比色皿/ 96 孔 UV 板、研缽/勻漿器、蒸餾水和氯

仿。

操作步驟：

一、樣本處理

1、 血清（漿）中 ATP  的提取：按照血清（漿）體積（mL）：提取液體積（mL）為 1：5~10 的比例（建議取約

0.1mL 血清（漿），加入 1mL  提取液），充分震蕩，10000g，4℃離心 10min；取上清液至另一 EP  管中，加入

500μL 的氯仿充分震蕩混勻，10000g 4℃離心 3min，取上清，置冰上待測（不可用于蛋白質(zhì)含量測定）。

2、 組織中 ATP  的提取：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g  組織，加入

1mL 提取液），進(jìn)行冰浴勻漿，8000g 4℃離心 10min，取上清至另一 EP  管中，加入 500μL 的氯仿充分震蕩混勻，10000g 4℃離心 3min，取上清，置冰上待測（不可用于蛋白質(zhì)含量測定）。

3、 細(xì)胞或細(xì)菌中 ATP  的提取：先收集細(xì)胞或細(xì)菌到離心管內(nèi)，棄上清，按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104  個）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液），超聲波破碎 1min（冰浴，強度 20％或 200W，超聲 2s，停 1s），10000g 4 ℃離心 10min；取上清液至另一 EP 管中，加入 500μL 的氯仿充分震蕩混勻，10000g 4℃離心 3min，取上清，置冰上待測（不可用于蛋白質(zhì)含量測定）。

二、測定步驟

1、 紫外分光光度計/酶標(biāo)儀預(yù)熱 30 min 以上，調(diào)節(jié)波長到 340nm，蒸餾水調(diào)零。

2、 將 10μmol/mL 的 ATP 標(biāo)準(zhǔn)溶液用蒸餾水稀釋 16 倍即 0.625μmol/mL 標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。

3、 加樣表：在微量石英比色皿或 96 孔 UV 板中加入

試劑名稱(μL)測定管標(biāo)準(zhǔn)管

樣本20

標(biāo)準(zhǔn)液20

試劑一128128

工作液5252

充分混合后，立即測定 340nm 下 10s 的吸光值 A1，然后將比色皿連同反應(yīng)液一起放入 37℃（哺乳動物）或 25℃（其他物種）水浴中反應(yīng) 3min，拿出擦拭干凈立即測定其在 3min10s 時的吸光值 A2。用96 孔板則放入 37℃（哺乳動物）或 25℃（其他物種）培養(yǎng)箱中（酶標(biāo)儀若自帶控溫功能，則將溫度調(diào)

至 37℃或 25℃）。分別計算ΔA 測定=A2 測定管-A1 測定管，ΔA 標(biāo)準(zhǔn)=A2 標(biāo)準(zhǔn)管-A1 標(biāo)準(zhǔn)管。

三、ATP 含量計算

1、 血清（漿）中 ATP 含量計算

ATP  含量(μmol/mL) =ΔA 測定÷（ΔA 標(biāo)準(zhǔn)÷C 標(biāo)準(zhǔn)）×（V 提取+V 血清（漿））÷V 血清（漿）

=6.875×ΔA 測定÷ΔA 標(biāo)準(zhǔn)

2、 組織、細(xì)菌或細(xì)胞中 ATP 含量計算

（1）按樣本質(zhì)量計算

ATP 含量（μmol/g 質(zhì)量）= ΔA 測定÷（ΔA 標(biāo)準(zhǔn)÷C 標(biāo)準(zhǔn)）×V 提取÷W

=0.625×ΔA 測定÷ΔA 標(biāo)準(zhǔn)÷W

（2）按細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量計算

ATP 含量(μmol/106 cell）=ΔA 測定÷（ΔA 標(biāo)準(zhǔn)÷C 標(biāo)準(zhǔn)）×V 提取÷5

=0.125×ΔA 測定÷ΔA 標(biāo)準(zhǔn)

C 標(biāo)準(zhǔn)：標(biāo)準(zhǔn)液濃度，0.625μmol/mL；V 提取：加入的提取液體積，1mL；V 血清（血漿）：血清（漿）體積，

0.1mL；W：樣本質(zhì)量，g；5：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，5×106 個。

注意事項：

1、 加入提取液離心后的上清若為渾濁為正常現(xiàn)象。

2、 提取過程嚴(yán)格在冰浴條件下進(jìn)行。

3、 如果吸光值大于 1.5，建議將樣本用提取液稀釋后進(jìn)行測定。

4、 提取液低溫條件下，可能有結(jié)晶析，放于 60℃水浴溶解即可，不影響使用。

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